Trzy biomarkery przewidujące skuteczność ustekinumabu w chorobie Crohna

Czy można przewidzieć skuteczność ustekinumabu przed rozpoczęciem leczenia?

Choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) pozostaje istotnym wyzwaniem terapeutycznym – mimo dostępności leków biologicznych, znaczna część pacjentów nie osiąga trwałej remisji endoskopowej. Ustekinumab (UST), przeciwciało monoklonalne blokujące wspólną podjednostkę p40 interleukiny-12 i interleukiny-23, stanowi uznaną opcję w leczeniu umiarkowanych do ciężkich postaci CD. Jednak dane z metaanaliz wskazują, że odpowiedź kliniczna w długim okresie (48–52 tygodnie) występuje u około 64% leczonych, co oznacza, że co trzeci pacjent nie odnosi korzyści z terapii.

Dotychczasowe próby identyfikacji czynników predykcyjnych odpowiedzi na UST – takich jak wiek, płeć, lokalizacja choroby czy stężenie leku w osoczu – przyniosły ograniczone i niejednoznaczne rezultaty. Brakuje biomarkerów o wysokiej mocy rozróżniającej, które jednocześnie miałyby biologiczne uzasadnienie i mogłyby być łatwo oznaczane w praktyce klinicznej. Tymczasem wytyczne STRIDE-II jasno wskazują gojenie endoskopowe jako długoterminowy cel terapeutyczny w CD, co podkreśla potrzebę narzędzi umożliwiających wczesną stratyfikację molekularną pacjentów.

Nowe technologie proteomiczne, w tym platforma Olink Proximity Extension Assay (PEA), pozwalają na wysokoprzepustową i wysoce specyficzną kwantyfikację białek o niskim stężeniu w osoczu. Panel Olink Immuno-Oncology wykazał już wartość predykcyjną w kontekście odpowiedzi na immunoterapię w raku przełyku oraz w odkrywaniu biomarkerów w chorobach zapalnych i nowotworowych. Czy podobne podejście może pomóc w prognozowaniu skuteczności UST w CD?

Jak zaprojektowano badanie i kogo włączono do analizy?

Autorzy przeprowadzili retrospektywną analizę danych z prospektywnie prowadzonego rejestru pacjentów z CD w Nanjing Drum Tower Hospital w Chinach. Do badania zakwalifikowano 40 pacjentów z umiarkowaną do ciężkiej postacią choroby, leczonych ustekinumabem przez co najmniej 24 tygodnie, u których wykonano kolonoskopię przed rozpoczęciem terapii i po 24–52 tygodniach leczenia. Grupę podzielono na 20 pacjentów z odpowiedzią endoskopową (redukcja wyniku SES-CD o ≥50%) i 20 pacjentów bez odpowiedzi.

Krew obwodową pobierano na czczo, przed pierwszą dawką indukcyjną UST. Osocze zamrażano w –80°C do czasu analizy proteomicznej z użyciem panelu Olink Target 96 Inflammation, który umożliwia jednoczesną kwantyfikację 92 białek zapalnych z zaledwie 1 μL osocza. Wyniki wyrażano jako znormalizowane wartości NPX (Normalized Protein Expression) w skali log2. Białka różnicowo wyrażone identyfikowano za pomocą pakietu limma w R, z korektą na wiek, wiek w momencie diagnozy i wyjściowy wynik SES-CD. Aby zapewnić stabilność wyników, przeprowadzono 500 iteracji bootstrap resampling – za stabilne białka różnicowo wyrażone uznano te, które były istotne statystycznie w co najmniej 80 iteracjach.

Wybrane białka walidowano metodą ELISA w niezależnej grupie 20 pacjentów (10 z odpowiedzią i 10 bez odpowiedzi). Następnie skonstruowano trzy modele uczenia maszynowego: regresję logistyczną, random forest oraz SVM (support vector machine), oceniając ich wydajność za pomocą krzywych ROC, AUC oraz standardowych metryk klasyfikacyjnych.

Czy grupy różniły się pod względem cech klinicznych?

Spośród 40 włączonych pacjentów, 58% stanowili mężczyźni, mediana wieku wynosiła 33 lata (IQR 27–41), a mediana czasu trwania choroby – 34 miesiące (IQR 27–59). Większość pacjentów (78%) zdiagnozowano między 17. a 40. rokiem życia. Pod względem lokalizacji choroby dominował typ jelitowo-okrężniczy (63%), a pod względem fenotypu – postać zwężająca (68%). Chorobę okołoodbytniczą stwierdzono u 35% badanych.

Istotne różnice między pacjentami z odpowiedzią a bez odpowiedzi dotyczyły wieku (mediana 28,5 vs 37,8 lat; P=0,004), wieku w momencie diagnozy (95% vs 60% w grupie A2; P=0,020) oraz wyjściowego wyniku SES-CD (mediana 17,0 vs 12,0; P=0,032). Pacjenci bez odpowiedzi byli starsi, częściej diagnozowani po 40. roku życia i mieli niższe wyjściowe nasilenie zmian endoskopowych. Co istotne, nie stwierdzono różnic w zakresie parametrów laboratoryjnych, w tym CRP, kałowego kalprotektyny (FC), ESR czy CDAI.

Które białka zapalne różnicują odpowiedź na ustekinumab?

Analiza proteomiczna z użyciem platformy Olink, po korekcie na kluczowe zmienne zakłócające (wiek, wiek w momencie diagnozy, wyjściowy SES-CD), wykazała trzy stabilne białka różnicowo wyrażone między pacjentami z odpowiedzią a bez odpowiedzi:

IL-8 (interleukina-8) – chemokina wydzielana głównie przez monocyty, makrofagi i neutrofile, odpowiedzialna za rekrutację neutrofilów do miejsc zapalenia. Jej poziom był istotnie podwyższony u pacjentów bez odpowiedzi (P<0,05). Indywidualna moc predykcyjna: AUC=0,605 (Olink), potwierdzenie ELISA: P=0,043, AUC=0,77. Podwyższone stężenie IL-8 sugeruje utrzymujące się, neutrofilozależne zapalenie, które może osłabiać skuteczność blokady IL-12/23.

CD6 – glikoproteina błonowa z rodziny immunoglobulin, ekspresjonowana głównie na limfocytach T, zaangażowana w aktywację komórek T i regulację odporności adaptacyjnej. Również była podwyższona u pacjentów bez odpowiedzi (P<0,05). AUC (Olink)=0,655; ELISA: P=0,023, AUC=0,80. Nadekspresja CD6 może odzwierciedlać nieprawidłową aktywację limfocytów T i dysfunkcję immunologiczną, przyczyniając się do niewystarczającej odpowiedzi na UST.

TSLP (thymic stromal lymphopoietin) – cytokina nabłonkowa o działaniu immunomodulacyjnym, ekspresjonowana w tkankach błon śluzowych. W CD obniżona ekspresja TSLP była związana z nasileniem zapalenia typu Th1. W badaniu TSLP był istotnie obniżony u pacjentów bez odpowiedzi (lub: podwyższony u pacjentów z odpowiedzią; P<0,05). AUC (Olink)=0,720 – najwyższa spośród trzech białek; ELISA: P=0,036, AUC=0,78. Niedobór TSLP może oznaczać brak mechanizmów regulacyjnych hamujących zapalenie, co nasila zapalenie Th1/Th17 i pogarsza wyniki leczenia.

Walidacja ELISA w niezależnej grupie 20 pacjentów (10 z odpowiedzią, 10 bez odpowiedzi) potwierdziła kierunek zmian wszystkich trzech białek, co dodatkowo wspiera ich potencjalną rolę jako biomarkerów predykcyjnych.

Jak skuteczne są modele predykcyjne oparte na trzech białkach?

Na podstawie IL-8, CD6 i TSLP skonstruowano wieloczynnikowy model regresji logistycznej. Analiza ważności zmiennych wykazała, że TSLP miał największą moc predykcyjną, następnie IL-8 i CD6. Model osiągnął AUC=0,828 (95% CI: 0,701–0,954) w oryginalnym zbiorze danych. W optymalnym punkcie odcięcia uzyskano:

• Dokładność (accuracy): 77,5%
• Czułość (sensitivity): 90,0%
• Swoistość (specificity): 65,0%
• PPV (positive predictive value): 72,0%
• NPV (negative predictive value): 86,7%
• Wskaźnik F1: 0,80

Stabilność modelu potwierdzono za pomocą 500 iteracji bootstrap (średnie AUC=0,850; 95% CI: 0,720–0,953) oraz walidacji krzyżowej leave-one-out (LOOCV) (AUC=0,775; 95% CI: 0,629–0,921). Dla ułatwienia klinicznego zastosowania autorzy opracowali nomogram oparty na modelu regresji logistycznej. Krzywa kalibracyjna z bootstrap resamplingiem wykazała jednak pewne niedoszacowania i przeszacowania przewidywanych prawdopodobieństw, co wskazuje na potrzebę dalszego dopracowania i walidacji zewnętrznej.

Dodatkowo przetestowano dwa algorytmy uczenia maszynowego: random forest (AUC=0,745; 95% CI: 0,736–0,753) oraz SVM (AUC=0,775; 95% CI: 0,628–0,922). Oba modele wykazały umiarkowaną i spójną zdolność generalizacji w walidacji bootstrap i LOOCV, choć nieco niższą niż regresja logistyczna. Wyniki te sugerują, że połączenie trzech białek zapalnych oferuje solidną podstawę do budowy narzędzi predykcyjnych, choć ostateczna weryfikacja wymaga testów w niezależnych grupach pacjentów.

Jakie mechanizmy mogą tłumaczyć rolę tych białek w odpowiedzi na UST?

Choroba Leśniowskiego-Crohna charakteryzuje się złożoną dysregulacją immunologiczną i zapaleniem napędzanym przez uszkodzenie tkanek. IL-8, będąc kluczową chemokiną neutrofilową, jest szeroko raportowana w przewlekłych chorobach zapalnych, w tym w reumatoidalnym zapaleniu stawów, POChP i łuszczycy, a także w nowotworach przewodu pokarmowego. Choć jej rola w wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego jest dobrze udokumentowana, dowody dotyczące CD – zwłaszcza jako biomarkera predykcyjnego odpowiedzi na leczenie – pozostają ograniczone. Podwyższony poziom IL-8 u pacjentów bez odpowiedzi sugeruje utrzymujące się, neutrofilozależne środowisko zapalne, które może podważać skuteczność blokady osi IL-12/23.

CD6, glikoproteina z nadrodziny immunoglobulin, bierze udział w aktywacji limfocytów T, tworzeniu synapsy immunologicznej i regulacji odporności adaptacyjnej. Polimorfizmy genu CD6 wiązano z podatnością na stwardnienie rozsiane, łuszczycę, reumatoidalne zapalenie stawów oraz IBD. Dane o ekspresji białka CD6 w CD są jednak nieliczne. Nadekspresja CD6 u pacjentów bez odpowiedzi może odzwierciedlać nieprawidłową aktywację limfocytów T i dysregulację immunologiczną, co przyczynia się do niewystarczającej odpowiedzi na UST.

TSLP jest cytokiną nabłonkową wyrażaną w tkankach śluzówkowych, wywierającą działanie immunomodulacyjne poprzez aktywację komórek dendrytycznych i przesunięcie w kierunku odporności typu Th2. W IBD rola TSLP jest zależna od kontekstu: obniżona ekspresja była związana z nasileniem zapalenia napędzanego przez Th1 w CD, podczas gdy podwyższone poziomy wiązano z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego zdominowanym przez Th2. W analizowanej grupie TSLP był istotnie obniżony u pacjentów bez odpowiedzi, co wskazuje na niedobór mechanizmów regulacyjnych, mogący nasilać zapalenie Th1/Th17 i pogarszać wyniki leczenia.

Warto podkreślić, że wcześniejsze badania wskazywały na wyjściowy poziom IL-23 jako predyktor odpowiedzi na ustekinumab w CD. Choć panel Olink Inflammation nie mierzy bezpośrednio IL-23 (zawiera IL-12/23p40, wspólną podjednostkę), autorzy przeprowadzili ukierunkowane pomiary ELISA w tej samej próbie 40 pacjentów. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, stężenie IL-23 było istotnie wyższe u pacjentów z odpowiedzią niż u pacjentów bez odpowiedzi (P=0,008), co potwierdza oczekiwany wzorzec ekspresji IL-23 i wspiera biologiczną istotność tego markera w odpowiedzi na UST. W przeciwieństwie do tego, dane proteomiczne ujawniły różnicową ekspresję IL-8, CD6 i TSLP – biomarkerów, które nie były szeroko oceniane we wcześniejszych badaniach.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej i przyszłych badań?

Wyniki niniejszego badania sugerują, że profilowanie osocza pod kątem IL-8, CD6 i TSLP przed rozpoczęciem terapii ustekinumabem może pomóc w identyfikacji pacjentów z wysokim ryzykiem braku odpowiedzi endoskopowej. Model predykcyjny oparty na tych trzech białkach osiągnął solidną moc rozróżniającą (AUC=0,828), przewyższając wcześniej opisywane modele tkankowe (np. AUC=0,746 dla modelu opartego na HSD3B1, MUC4, CF1, CCL11). Co istotne, badanie wykorzystuje łatwo dostępne próbki krwi obwodowej, co oferuje praktyczne korzyści dla translacji klinicznej.

Jeśli te wyniki zostaną potwierdzone w większych, niezależnych grupach, wyjściowe profilowanie proteomiczne mogłoby:

• Ułatwić wczesną stratyfikację molekularną pacjentów przed rozpoczęciem kosztownej terapii biologicznej
• Pomóc w optymalizacji wyboru leku biologicznego w sytuacji, gdy dostępnych jest kilka opcji
• Wspierać monitorowanie aktywności choroby i ocenę ryzyka nawrotu
• Dostarczyć podstaw do personalizacji terapii w ramach medycyny precyzyjnej w IBD

Niemniej jednak, badanie ma istotne ograniczenia. Była to analiza retrospektywna jednoośrodkowa z relatywnie małą próbą (n=40), co może ograniczać moc statystyczną i uogólnienie wyników. Chociaż przeprowadzono solidną walidację wewnętrzną za pomocą bootstrap resamplingu i LOOCV, walidacja zewnętrzna w niezależnych grupach pozostaje niezbędna. Ponadto analiza proteomiczna była ograniczona do jednej platformy omicznej (panel Olink Inflammation), co mogło wykluczyć inne potencjalnie istotne biomarkery. Wreszcie, proponowane mechanistyczne powiązania między IL-8, CD6, TSLP a odpowiedzią na UST, choć biologicznie prawdopodobne, pozostają hipotezami; niniejsze wyniki odzwierciedlają asocjacje, a nie związki przyczynowe.

Przyszłe badania powinny dążyć do walidacji tych ustaleń w większych, wieloośrodkowych grupach oraz integrować podejścia multi-omiczne – takie jak genomika i transkryptomika – aby zapewnić bardziej kompleksowe zrozumienie molekularnych determinant odpowiedzi na UST.

Jakie są kluczowe wnioski z tego badania?

Badanie zidentyfikowało trzy białka zapalne w osoczu – IL-8, CD6 i TSLP – które mierzone przed rozpoczęciem leczenia ustekinumabem dokładnie przewidują długoterminową odpowiedź endoskopową u pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna. Model regresji logistycznej łączący te trzy markery osiągnął solidną wydajność predykcyjną (AUC=0,828, dokładność 77,5%, czułość 90%), przewyższając modele random forest i SVM. Różnicowa ekspresja tych białek została potwierdzona metodą ELISA w niezależnej grupie walidacyjnej. Wyniki dostarczają podstaw do opracowania spersonalizowanych strategii terapeutycznych i kierują przyszłe badania na walidację oraz eksplorację mechanistycznych ról tych biomarkerów w większych, niezależnych grupach. Jeśli potwierdzone, profilowanie proteomiczne może stać się cennym narzędziem w optymalizacji terapii biologicznej w CD.