Efferocytosis w UC – od mechanizmów komórkowych do terapii biologicznej

Jak efferocytosis kształtuje stan zapalny w UC?

Efferocytosis, czyli proces usuwania komórek apoptotycznych, odgrywa kluczową rolę w patogenezie wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (UC). Najnowsze badania wskazują, że zaburzenia tego mechanizmu mogą znacząco wpływać na nasilenie stanu zapalnego w jelicie oraz odpowiedź na leczenie biologiczne. Zespół badaczy przeprowadził kompleksową analizę z wykorzystaniem danych transkryptomicznych, proteomicznych oraz modeli zwierzęcych, aby zidentyfikować kluczowe szlaki i geny związane z efferocytosis w UC.

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego charakteryzuje się rozlanym i nawracającym zapaleniem błony śluzowej, prowadzącym do uszkodzenia jelita i objawów takich jak biegunka czy krwawienie z odbytnicy. Efferocytosis stanowi wewnętrzny mechanizm przeciwzapalny, który hamuje nadmierny stan zapalny poprzez szybkie usuwanie komórek apoptotycznych za pomocą sekwencyjnych sygnałów “znajdź mnie”, “zjedz mnie”, “nie jedz mnie” i “strawić mnie”. Proces ten zapobiega uwalnianiu cząsteczek związanych z uszkodzeniem tkanek (DAMPs) poprzez efektywne usuwanie martwych lub uszkodzonych komórek, hamując tym samym kaskady zapalne. Badania wykazały, że zaburzenia efferocytosis nasilają uszkodzenie błony śluzowej w UC poprzez akumulację apoptotycznych komórek nabłonkowych, co podtrzymuje stan zapalny i upośledza naprawę bariery jelitowej.

Jakie sekrety odkrywa analiza pojedynczych komórek?

Badacze wykorzystali publicznie dostępne zbiory danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, aby mapować zaangażowanie różnych subpopulacji komórkowych okrężnicy w poszczególnych fazach efferocytosis u pacjentów z zapaleniem jelita grubego. “Nasza analiza ujawniła, że makrofagi o polaryzacji M2 wykazywały najwyższą zdolność efferocytosis” – piszą autorzy badania. To odkrycie ma istotne znaczenie kliniczne, ponieważ wskazuje na potencjalną rolę terapeutyczną M2 makrofagów w leczeniu UC.

Metodologia badania obejmowała wyszukiwanie w bazach danych GEO z użyciem słowa kluczowego “ulcerative colitis”, z zastosowaniem kryteriów filtrowania: dane musiały pochodzić od ludzi oraz zawierać co najmniej pięć próbek zdrowej kontroli i pięć próbek UC. Ostatecznie włączono jeden zestaw danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (GSE214695) oraz osiem zestawów danych mRNA (GSE193677, GSE66407, GSE75214, GSE107499, GSE206285, GSE92415, GSE23597, GSE73661). Lista genów związanych z efferocytosis została utworzona przez połączenie list genów “znajdź mnie”, “zjedz mnie”, “nie jedz mnie” i “strawić mnie” z kilku referencji.

Czy makrofagi mogą stać się celem terapii?

Analiza danych pojedynczych komórek z biopsji okrężnicy od pacjentów z UC i zdrowych osób kontrolnych wykazała znaczące różnice w proporcjach komórkowych. U pacjentów z UC zaobserwowano istotne zmniejszenie odsetka komórek nabłonkowych jelita wraz z wyraźnym wzrostem poziomu komórek mieloidalnych i komórek plazmatycznych/limfocytów B. Badanie sygnałów efferocytosis wskazuje, że komórki mieloidalne wykazują najsilniejsze sygnały “zjedz mnie” i “strawić”, podczas gdy funkcja chemotaktyczna “znajdź mnie”, kluczowa dla chemotaksji efferocytosis, jest głównie aktywowana w komórkach stromalnych. Te odkrycia sugerują, że wzmocnienie sygnalizacji efferocytosis w UC jest przede wszystkim związane z komórkami mieloidalnymi i stromalnymi.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę komórek mieloidalnych w sygnałach “zjedz mnie” i “strawić”, badacze zidentyfikowali ich skład subpopulacyjny. Przy rozdzielczości 0,3 zidentyfikowano osiem klasterów, które zostały skategoryzowane w cztery subpopulacje: komórki tuczne (klaster: 0, 6), makrofagi (klaster: 1, 2, 3, 5), neutrofile (klaster: 4) i eozynofile (klaster: 7). Makrofagi, szczególnie podtyp M2, wykazywały najsilniejsze zdolności efferocytosis. Analiza pseudoczasu wskazuje, że zdolność efferocytosis makrofagów jest odwrotnie proporcjonalna do ich fenotypu prozapalnego. Po różnicowaniu w podtyp M2 makrofagi wykazują najsilniejszą zdolność efferocytosis, podczas gdy różnicowanie w podtyp M1 prowadzi do najsłabszej zdolności efferocytosis.

Co istotne, w okrężnicy pacjentów z aktywnym UC zaobserwowano znaczące zmniejszenie proporcji makrofagów M0 i M2, przy jednoczesnym wyraźnym wzroście proporcji makrofagów M1 i IDA. Wyniki potwierdzają wyczerpanie makrofagów M2 i towarzyszące upośledzenie efferocytosis u pacjentów z UC, co jest zgodne z ustaloną przeciwzapalną rolą makrofagów M2 w rozwiązywaniu stanu zapalnego. Czy te zmiany w populacjach makrofagów mogą stanowić cel terapeutyczny? To pytanie wymaga dalszych badań, ale uzyskane wyniki sugerują, że stymulacja polaryzacji makrofagów w kierunku fenotypu M2 mogłaby być obiecującą strategią leczenia UC.

Jakie tajemnice odkrywa komunikacja komórkowa w UC?

Następnie badacze zaobserwowali różnice w sygnałach efferocytosis w makrofagach M2 między grupami CON (kontrolną) i UC. W porównaniu z grupą CON, makrofagi M2 w grupie UC wykazywały zwiększoną ekspresję cząsteczek “zjedz mnie”, sugerując, że bodźce zapalne mogą wzmacniać zdolność fagocytozy makrofagów M2. Analiza wzbogacenia przeprowadzona na różnicowo wyrażonych genach między podtypami makrofagów wykazała znaczące wzbogacenie genów regulowanych w górę w szlakach proteasomu i fagosomu, sugerując, że makrofagi M2 mogą odgrywać bardziej aktywną rolę w okrężnicy pacjentów z aktywnym UC poprzez wzmocnienie funkcji proteasomu i fagosomu, co może skuteczniej usuwać komórki apoptotyczne, przyczyniając się do zmniejszenia stanu zapalnego.

Badacze przeanalizowali również komórki stromalne z najsilniejszymi chemotaktycznymi sygnałami “znajdź mnie”. Przy rozdzielczości 0,1 zidentyfikowano cztery klastry, które zostały skategoryzowane w 3 subpopulacje: komórki śródbłonka (klaster: 2), fibroblasty (klaster: 0, 1) i komórki glejowe (klaster: 3). Fibroblast1_S1/S3 (klaster 0) jest głównie odpowiedzialny za produkcję i utrzymanie macierzy pozakomórkowej, podczas gdy Fibroblast2_S4 (klaster 1) jest zaangażowany w stan zapalny i sieciowanie kolagenu. Analiza efferocytosis w różnych podtypach komórek wskazuje, że fibroblasty i komórki śródbłonka mają podobne zdolności chemotaktyczne. Porównanie międzygrupowe wśród tego samego typu komórek pokazuje, że poza niewielkim zmniejszeniem zdolności chemotaktycznej zapalnych fibroblastów (Fibroblast2_S4) u pacjentów z UC, nie ma znaczących różnic między innymi podtypami komórek w grupach. Ilościowo, proporcja fibroblastów_S1/3, o wyższej zdolności chemotaktycznej, znacząco zmniejsza się w UC, podczas gdy zapalne fibroblasty_S4 stają się dominującym typem fibroblastów w UC.

Analiza komunikacji komórkowej ujawniła, że UC wzmacnia interakcję między fibroblastami a makrofagami w okrężnicy. Niezależnie od tego, czy w grupie CON czy UC, fibroblasty są typem komórek mającym najwięcej interakcji z makrofagami. Makrofagi M1 są typem komórek z najbardziej znaczącymi zmianami liczby interakcji w okrężnicy z UC. Oddzielna analiza fibroblastów wskazuje, że w porównaniu z grupą CON, liczba interakcji między fibroblastem 1 okrężnicy a makrofagami M1 w grupie UC wzrosła z 0 do 35 par, podczas gdy liczba interakcji z makrofagami M2 zmniejszyła się z 58 do 45 par. W przypadku fibroblastów 2, liczba interakcji z makrofagami M1 wzrosła z 0 do 44 par, a liczba interakcji z makrofagami M2 zmniejszyła się z 60 do 55 par.

Analiza efferocytosis-związanych par ligand-receptor wskazuje, że interakcje efferocytosis między dwoma typami fibroblastów i makrofagami są zapośredniczone przez siedem par ligand-receptor, z istotną heterogennością. W porównaniu z grupą CON, interakcje efferocytosis między dwoma typami fibroblastów a makrofagami M1 w okrężnicy UC są wzmocnione, głównie za pośrednictwem par ligand-receptor ANXA1_FPR1, ANXA1_FPR2 i THBS1_CD47. Jednak liczba par ligand-receptor efferocytosis między fibroblastem 1 a makrofagami IDA i makrofagami M2 zmniejsza się (interakcje PROS1_AXL i MDK_LRP1 zanikają), podczas gdy liczba par ligand-receptor efferocytosis między fibroblastem 2 a makrofagami IDA (ANXA1_FPR1 i THBS1_CD47) i makrofagami M2 (TGFB1_TGFBR1_TGFBR2) znacząco wzrasta.

Jak genetyka wspiera diagnostykę i terapię w UC?

Aby zidentyfikować kluczowe geny związane z efferocytosis, badacze przeanalizowali dane bulk RNA-seq z dużych publicznych zestawów danych UC. Zidentyfikowano 4388 genów różnicowo ekspresjonowanych między 293 próbkami UC a 461 próbkami zdrowej kontroli, w tym 2653 geny regulowane w górę i 1735 regulowane w dół. Spośród 115 genów związanych z efferocytosis wykryto ekspresję 99 w zestawie danych. Aby uzyskać wiarygodne różnicowe geny związane z efferocytosis, przesiewano przecięcie genów różnicowych i genów związanych z efferocytosis na podstawie standardu |Fold Change| ≥ 1,5. Przesiewano łącznie 29 różnicowych genów związanych z efferocytosis, 24 były regulowane w górę, a 5 było regulowanych w dół.

Następnie zastosowano analizę WGCNA (Weighted Gene Co-expression Network Analysis) z indeksem dopasowania ≥ 0,85 i β = 7, aby dalej przesiewać różnicowe geny związane z efferocytosis związane z UC. W sumie 25 modułów koekspresji, moduły Pink, Salmon, RoyalBlue i LightCyan wykazały silną dodatnią korelację z UC. Przecinając geny z kluczowych modułów z różnicowymi genami związanymi z efferocytosis, uzyskano łącznie 9 genów charakterystycznych. Następnie badacze opracowali strukturę uczenia maszynowego zaprojektowaną do identyfikacji genów centralnych poprzez rozwiązanie siedmiu odrębnych zadań klasyfikacji binarnej. Poprzez systematyczną ocenę miar wydajności algorytmów (AUC, dokładność i wynik F1), analiza porównawcza ujawniła, że maszyna wektorów nośnych (SVM) i ekstremalny gradient boosting (XGBoost) wykazały lepszą skuteczność predykcyjną w porównaniu z innymi modelami. Integrując rekurencyjną eliminację cech (RFE) do selekcji cech, zidentyfikowano siedem genów centralnych (Panx1, Anxa1, Anxa5, Cd93, Mfge8, Calr i Serpine1), które były konsekwentnie priorytetyzowane przez oba algorytmy.

Czy geny hub mogą przewidzieć skuteczność leczenia?

Aby potwierdzić wiarygodność kluczowych genów, badacze zweryfikowali ich ekspresję w wielu zestawach danych obejmujących różne stadia choroby i różne warunki uszkodzenia. “Ekspresja genów hub w tkance okrężnicy wzrasta wraz z nasileniem choroby” – podsumowują badacze. Z wyjątkiem MFGE8 i CALR, ekspresja innych genów hub u pacjentów z ciężką postacią choroby jest znacząco wyższa niż u pacjentów z łagodną lub niższą stopniem choroby lub u zdrowych osób. Podobnie ekspresja genów hub w tkance okrężnicy w fazie aktywnej jest znacząco wyższa niż w tkankach zdrowych i w fazie nieaktywnej. Ponadto zestawy danych GSE66407 i GSE107499 pokazują, że nie ma różnicy w ekspresji genów hub między zdrowymi a niezapalnymi/niezmienionymi tkankami, przy wysokiej ekspresji głównie w tkankach zapalnych lub zmienionych. Dodatkowo stwierdzono, że ekspresja genów hub nie jest związana z zakresem zmian UC, ponieważ nie ma różnicy w ich ekspresji między tkankami rozległymi a ograniczonymi.

Interesujące wyniki uzyskano analizując związek ekspresji genów hub z odpowiedzią pacjentów na leki biologiczne, takie jak ustekinumab (UST), vedolizumab (VDZ) oraz inhibitory TNF-α: infliksimab (IFX) i golimumab (GLM). Przed leczeniem UST, z wyjątkiem CALR, ekspresja genów hub u pacjentów z UC niereagujących na leczenie jest znacząco wyższa niż u osób zdrowych i pacjentów reagujących na leczenie, podczas gdy ekspresja u pacjentów reagujących jest wyższa niż u osób zdrowych, niezależnie od tego, czy ocena opiera się na remisji klinicznej czy gojeniu błony śluzowej. Analiza ROC dodatkowo potwierdziła zdolność predykcyjną tych genów hub, przy czym model wielogenowy osiągnął AUC 0,671 dla remisji klinicznej i 0,693 dla gojenia błony śluzowej. Jednak nie zaobserwowano różnic w ekspresji genów hub między pacjentami reagującymi i niereagującymi przed podaniem GLM, IFX i VDZ, chociaż niektóre geny wykazywały regulację w dół w grupie reagującej po podaniu leku.

Aby zbadać potencjalne interakcje między UST a kluczowymi genami hub z wyjątkiem CALR, przeprowadzono badania dokowania molekularnego. Z wyjątkiem ANXA5, wszystkie pozostałe geny hub są zdolne do tworzenia struktur z lekkimi lub ciężkimi łańcuchami UST z energiami wiązania niższymi niż -5 kcal/mol, co sugeruje, że białka kodowane przez te geny mają silne powinowactwo do UST i mogą tworzyć stabilne kompleksy. Wyniki te sugerują, że sygnalizacja efferocytosis jest kluczowym czynnikiem wpływającym na reaktywność lekową w UST.

Jak eksperymentalne modele potwierdzają odkrycia?

W celu dalszego potwierdzenia ważnej roli genów hub w UC, badacze wykorzystali mysz model zapalenia jelita grubego indukowanego przez DSS. Samce myszy C57BL/6J (~25g) zostały uzyskane z Gempharmatech (Chengdu, Chiny). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku po Opiece i Użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych Narodowych Instytutów Zdrowia. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycyny Tradycyjnej Chengdu. Myszy zostały losowo przydzielone do grupy kontrolnej i grupy DSS. Myszom w grupie DSS podawano 2,5% DSS (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA) w wodzie pitnej przez 7 dni, a grupie kontrolnej podawano tylko wodę destylowaną.

W porównaniu z grupą kontrolną, myszy w grupie DSS wykazywały wyraźną utratę masy ciała, zmniejszoną długość okrężnicy, zwiększony wynik DAI i ciężkie nacieki zapalne. Następnie wykryto poziomy ekspresji genów hub za pomocą RNA-seq i ASTRAL-DIA Proteomic. W porównaniu z grupą kontrolną, poziomy mRNA i białka Anxa1, Cd93 i Mfge8 były znacząco podwyższone w grupie DSS, podczas gdy inne geny hub nie wykazywały spójnego trendu z danymi klinicznymi. Wyniki te dostarczają międzygatunkowych dowodów potwierdzających funkcję i regulację sygnalizacji efferocytosis w UC.

Jakie są praktyczne implikacje dla klinicystów?

Efferocytosis, znany również jako usuwanie komórek apoptotycznych lub zaprogramowane usuwanie komórek, jest wyspecjalizowaną formą fagocytozy, która odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy tkankowej, łagodzeniu pozaurazowych odpowiedzi zapalnych i ułatwianiu regeneracji tkanek. Pojawiające się dowody podkreślają jego funkcję regulacyjną w modulowaniu kaskad zapalnych, pozycjonując efferocytosis jako obiecujący cel terapeutyczny w leczeniu zapalenia jelita grubego. Ta strategia terapeutyczna wykazuje znaczny potencjał jako przyszły kierunek leczenia choroby w trwających badaniach. Niemniej jednak, patologiczne implikacje efferocytosis w kontekście wrzodziejącego zapalenia jelita grubego nie są jeszcze w pełni wyjaśnione. W związku z tym, pogłębienie naszego zrozumienia efferocytosis i wskazanie nowych celów terapeutycznych dla UC ma kluczowe znaczenie.

Jakie są praktyczne implikacje tych odkryć dla klinicystów? Przede wszystkim, zidentyfikowane geny hub mogą służyć jako biomarkery ciężkości choroby i potencjalne cele terapeutyczne. Ponadto, ich związek z odpowiedzią na ustekinumab sugeruje możliwość wykorzystania ich jako predyktorów skuteczności terapii, co mogłoby pomóc w personalizacji leczenia. Czy w przyszłości będziemy rutynowo badać ekspresję tych genów przed wyborem terapii biologicznej? To pytanie pozostaje otwarte, ale wyniki tego badania z pewnością przybliżają nas do ery medycyny spersonalizowanej w leczeniu UC.

Nasze odkrycia rozszerzają wcześniejsze prace poprzez rozwiązanie dynamiki efferocytosis w rozdzielczości pojedynczej komórki i integrację walidacji międzygatunkowej. Podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się na polaryzacji makrofagów, nasze dane podkreślają dysregulację specyficzną dla szlaku, ujawniając rozmowę mieloidalno-stromalną jako oś terapeutyczną. Istnieją jednak ograniczenia: mała kohorta scRNA-seq może nie reprezentować wystarczająco rzadkich podzbiorów komórek, a myszy z zapaleniem jelita grubego wywołanym przez DSS nieadekwatnie modelują przewlekłe włóknienie UC. Po trzecie, związek między genami hub związanymi z efferocytosis (ANXA1, CD93 itp.) a odpowiedzią na UST wynikał wyłącznie z analizy kohorty GSE206285. To odkrycie z pojedynczego zestawu danych nie ma zewnętrznej walidacji i nie mogło zostać dostosowane do kluczowych czynników zakłócających klinicznych (np. wyjściowa ciężkość choroby, wcześniejsza ekspozycja na leki biologiczne), co wymaga ostrożnej interpretacji i prospektywnej walidacji. Wreszcie, podczas gdy dokowanie molekularne przewidywało komplementarność strukturalną między UST a kilkoma białkami hub, te wyniki obliczeniowe nie ustalają biologicznego znaczenia dla pierwotnego mechanizmu blokady IL-12/IL-23 przez UST i wymagają eksperymentalnej walidacji w celu określenia funkcjonalnego znaczenia.

Podsumowanie

Najnowsze badania nad efferocytosis w wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (UC) dostarczyły istotnych informacji o patogenezie choroby i potencjalnych celach terapeutycznych. Analiza na poziomie pojedynczych komórek wykazała, że makrofagi M2 posiadają najwyższą zdolność efferocytosis, a ich niedobór w UC przyczynia się do nasilenia stanu zapalnego. W tkance jelitowej pacjentów z UC zaobserwowano znaczące zmniejszenie proporcji makrofagów M0 i M2, przy jednoczesnym wzroście makrofagów M1. Badania zidentyfikowały siedem kluczowych genów hub (Panx1, Anxa1, Anxa5, Cd93, Mfge8, Calr i Serpine1), których ekspresja koreluje z ciężkością choroby. Co istotne, ekspresja tych genów może przewidywać odpowiedź na leczenie ustekinumabem, osiągając wartość AUC 0,671 dla remisji klinicznej i 0,693 dla gojenia błony śluzowej. Odkrycia te otwierają nowe możliwości w diagnostyce i personalizacji terapii UC, choć wymagają dalszej walidacji w większych kohortach pacjentów.